リアルタイムPCRとは？原理・手法・選び方・おすすめメーカーをご紹介

2024.1.15

この記事では、リアルタイムPCRの原理や、手法の違い、装置の選び方などについて解説いたします。ぜひ最適な手法や、装置の選定にお役立てください。

実験内容に合わせた装置選びに迷われた際は、池田理化がご要望にあわせた最適な装置をご提案させていただきます。
まずはお気軽にご相談ください。

リアルタイムPCRについて相談してみる

目次

リアルタイムPCRとは

リアルタイムPCRは、PCRによるDNA増幅をリアルタイムにモニタリングすることで、テンプレートDNA（※1）の定量を行う「定量PCR」の一つです。

PCR後に電気泳動で増幅産物の確認を行う必要がないため、操作が簡便で迅速に結果が得られることや、コンタミネーションのリスクが低いことなどが特長です。
このため、遺伝子発現解析のほか、疾患の診断や治療法の選択に使われるSNPsタイピング、ウイルスや病原菌の検出など、多種多様な用途で用いられています。


※1…　最初の鋳型となるDNAのこと

PCRやデジタルPCRとの違い

リアルタイムPCRは、「PCR」や「デジタルPCR」とは何が違うのでしょうか？それぞれについて簡単にご説明いたします。

PCRとは

デジタルPCRとは

デジタルPCRはリアルタイムPCRよりもさらに高感度・高精度な定量を可能とする技術です。

0～1分子のDNAが微小区画に分散するようにサンプルを限界希釈した状態でPCRを行い（上図-①）、微小区画ごとの増幅シグナルを検出します。このため、リアルタイムPCRでは検出できないような微量な遺伝子発現量でも検出することが可能です。
また、微小区画内のターゲットとなるDNAが0分子であれば増幅シグナルは得られず、1分子の場合は増幅シグナルを得ることができるので、これをカウントすることでターゲット遺伝子の発現量を絶対的に測定することが可能です（上図-②）。

後述するように、リアルタイムPCRでも「絶対定量法」と呼ばれる手法がありますが、これはスタンダードとなるサンプルとの比較によって定量を行う方法です。したがって、デジタルPCRの方がより高精度な定量が可能と言えます。

PCR、リアルタイムPCR、デジタルPCRの比較

PCR、リアルタイムPCR、デジタルPCRの特徴を以下にまとめました。

	概要	定量性	感度	精度	操作性	費用	おすすめの用途
PCR	熱サイクルを反復してPCRを促し、DNAを増幅する	△	△	△	△	◎ 安価	シーケンシング、ジェノタイピング、クローニングなどを目的としたDNA増幅
リアルタイムPCR	PCRによってDNAを増幅し、その増幅率をリアルタイムでモニタリングすることで、DNAの定量を行う	〇	〇	〇	〇	〇	・遺伝子発現の定量 ・マイクロアレイ検証 ・品質管理およびアッセイの検証 など
デジタルPCR	限界希釈したサンプルDNAを微小区画内に分散させてPCRを行い、DNAが増幅した微小区画の数を数えて定量を行う	◎	◎	◎	◎	△ 高価	・ウイルス量の絶対定量 ・核酸標準品の絶対定量 など

池田理化では実施される実験内容に応じて、最適な機器をご提案させていただきます。
どの装置がご自身の使用環境に最適かお悩みの際は、お気軽にご相談ください。


装置の選び方について相談してみる

リアルタイムPCRの原理と主な手法

蛍光検出方法の種類

リアルタイムPCRでは、PCR産物の増幅量のモニタリングに蛍光物質を用います。

蛍光物質による検出方法には、大きく分けて「インターカレーター法」と「蛍光標識プローブ法」があります。
蛍光標識プローブ法は、使用するプローブによって多くの種類に分けられますが、ここでは2種類の手法を紹介します。

インターカレーター法

インターカレーターは、単体では蛍光を発しませんが（上図-②）、二本鎖DNAに結合した状態で励起光を照射すると蛍光を発します（上図-③）。
この性質を利用し、反応に伴う蛍光強度を測定することで、PCR産物の生成量をモニタリングする方法を「インターカレーター法」と呼びます。

おすすめの用途

メリット

デメリット

比較的手軽に始められるのがこの手法のメリットですが、上述のようなデメリットがあるため、反応自体に特異性が求められます。
したがって、プライマーの設計や反応条件が最適化できている場合におすすめです。


※4…　プライマー同士で相補的な配列のある場合にその部分がアニーリングし、ターゲットである鋳型DNA同様に増幅してしまった目的外の増幅産物。サイズが短いため、鋳型DNAの増幅産物よりも増幅効率が高いこともあり、検出感度の低下に影響する。

蛍光標識プローブ法 

蛍光標識プローブは、片方の末端が蛍光物質、もう片方の末端が蛍光の発生を抑制するクエンチャー物質で修飾されています。蛍光物質は、クエンチャー物質との物理的距離が近いと蛍光を発しませんが、クエンチャー物質との物理的距離が離れると、励起光の照射によって蛍光を発する性質を持っています。
また、プローブはアニーリングのステップでターゲットDNAの任意の配列に特異的にハイブリダイズする（※5）設計になっています。この性質を利用し、反応過程でプローブが分解されることにより発生する蛍光強度を測定することで、PCR産物の生成量をモニタリングする方法を「蛍光標識プローブ法」と呼びます。


※5…　DNAやRNAといった核酸が相補的な配列と複合体を形成すること

プローブ法

蛍光標識プローブ法のうち、プローブ法（5'-ヌクレアーゼ法）は、5’末端を蛍光物質、3’末端を蛍光の発生を抑制するクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる方法です（上図-①）。
伸長反応の過程で、Taq DNA ポリメラーゼの持つ5' → 3'エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、蛍光物質が遊離し、クエンチャーによる抑制がなくなります（上図-③）。
その際に発生する蛍光強度を測定することで、PCR産物の生成量をモニタリングします。

おすすめの用途

メリット

デメリット

上述の理由から、インターカレーター法よりも精度の高い解析結果が必要な場合は、プローブ法がおすすめです。
また、ご自身の求めるプローブが既製品にある場合は、反応条件が最適化されているので、サンプルさえあれば実験を開始することができることもメリットのひとつです。

一方、新たにプローブを設計する場合、プローブがターゲット遺伝子の任意の配列のみに相補的であることのほか、プライマー配列との相補性がないことや、それぞれが最適な位置関係にあるかどうかなど、多くの点を考慮しなければなりません。
継続的にプローブ設計が必要な場合は専用ソフト、単発の場合は受託を活用するのも良いかもしれません。

サイクリングプローブ法

蛍光標識プローブ法のうち、サイクリングプローブ法は、サイクリングプローブと呼ばれるキメラオリゴヌクレオチドをPCR反応系に加えます。
このキメラオリゴヌクレオチドは、RNAとDNAから成り、RNA部分をはさんで片方の末端が蛍光物質、もう片方の末端がクエンチャー物質で修飾されています（上図-①）。
RNase HによってRNA部分が切断されると、蛍光物質とクエンチャー物質の物理的距離が離れ、蛍光を発します（上図-②～③）。この蛍光強度を測定することで、PCR産物の生成量をモニタリングします。

おすすめの用途

メリット・デメリット

上述の通り、1塩基の違いを検出できるため、SNPsタイピングなどを行いたい場合におすすめです。
プローブ法を用いてSNP解析を行う場合は２種類のプローブを用意する必要があるため、ひとつのプローブでSNP解析ができることはサイクリングプローブ法の大きなメリットのひとつです。 

定量方法の種類

リアルタイムPCRを活用した定量方法には、絶対定量法と相対定量法の2種類があります。

絶対定量法

絶対定量法は、ターゲット遺伝子のDNA量が既知のサンプルで作成した検量線を用いて、研究対象となるサンプルのターゲット遺伝子の発現量を定量化する手法です。
既知のサンプルを段階希釈して（上図-①）リアルタイムPCRを行うと、そのDNA量の多いサンプルから順に増幅曲線が等間隔で並ぶグラフが作成できます（上図-②）。
それらから得られる各Ct値で検量線を作成し、未知のサンプルのCt値を検量線に当てはめることで、未知のサンプルのDNA量を求めることができます（上図-③）。

おすすめの用途

ターゲット遺伝子の実際のDNA量が知りたい方におすすめです。ただし、下記３点を考慮する必要があります。

2については、これらの影響でPCRの反応効率に差が出てしまい、本来のCt値からずれてしまう可能性があることが理由です。
たとえば、スタンダードサンプルの純度だけが極端に高ければ、それと比べて研究対象のサンプルの反応効率は悪くなる可能性があります。
また、スタンダードサンプルがゲノムDNA、研究対象のサンプルがプラスミドDNAであれば、形状が大きく異なるため、これもCt値に影響してしまう可能性があります。

3については、検量線の精度が解析結果の精度に繋がること、また、正確な検量線を作成できることは精度の高いピペット操作ができていることのひとつの目安とできることが理由です。
段階希釈が上手くできていれば等間隔な増幅曲線が得られますが、そうでない場合は値がばらつきます。
リアルタイムPCRでは僅かなテンプレートDNA量の差がCt値に影響するため、実験全体でピペット操作に高い精度が求められます。ピペット自体のメンテナンスもしっかりと行いましょう。


ピペットメンテナンスについて詳しく知りたい（YouTubeへ）

相対定量法

リアルタイムPCRを選ぶ8つのポイント

リアルタイムPCRはさまざまなメーカーから発売されていますが、その特長や性能はそれぞれ異なります。装置を選定する際の8つのポイントは以下の通りです。

1．サンプル数・量

装置によって、同時測定できるサンプル数は異なります。96ウェルの装置が一般的ですが、それよりも多い384ウェル、5184ウェルなどもあるため、解析したいサンプル数にあわせて検討しましょう。ブロックごと交換してサンプル数を変えられる装置もあります。
また、必要となる反応液量が少なければ、1解析あたりの試薬量は少なく済みます。一般的にはウェル数が多くなるほど必要な反応液量も少なくなりますが、同じウェル数でも必要な反応液量が異なる場合もあるため、確認するとよいでしょう。

2．温度制御精度

PCRは温度の上昇下降を繰り返す反応のため、装置の温度制御の正確性が反応の成否に関わる場合があります。
また、サンプルを入れたブロック全体の温度を均一に制御できるかどうかも、正確で再現性のある実験結果を得るために重要です。精度の高い制御機能で温度を常に最適化できれば、非特異的な反応を防ぐことができ、反応効率が上がります。

3．加温・冷却速度

PCR反応は温度を上下させることによって進むため、温度の正確性だけでなく、加温や冷却のスピードも重要です。目的温度まで短時間で到達できる装置であれば、PCRそのものにかかる時間を大きく短縮でき、非特異的な反応も抑えることができます。

4．対応蛍光色素数

装置によって、検出できる蛍光色素の種類は異なります。実験で使用したプローブの蛍光標識が検出できなければ定量ができないため、その装置に搭載されている波長域が、使用するプローブの蛍光標識に対応しているかどうか、確認が必要です。
また、2種類以上のターゲットDNAを同時にPCRで増幅し、同時に検出したい場合は、同一のウェルから異なる蛍光色素を正確に検出できるマルチプレックスに対応した装置を選ぶとよいでしょう。

5．グラジエント機能

グラジエント機能は、一つのブロック内でウェルごとに温度勾配を設定できる機能です。PCR反応の最適な温度条件を検討する際、条件を変えながら何度も実験したり、設定温度を変えたPCR装置を複数台動かしたりすると、手間も時間もかかります。
しかし、グラジエント機能を有する装置であれば、一度の実験で最適な温度条件を評価できるため、とても便利です。

6．対応試薬・容器・シール

PCRに使用する試薬は、リアルタイムPCR装置のメーカーごとに発売されており、蛍光検出方法や実験目的によってさまざまな種類があるため、その中から最適なものを選んで使用するのがベストです。他メーカーの試薬を使う場合は、その試薬に含まれる蛍光物質に装置の波長や解析ソフトが対応しているかを確認する必要があります。
また、反応チューブや反応プレート、プレートに貼るシールは、メーカーから各装置の仕様に合わせたものが発売されているので、それを使用するのがおすすめです。装置と異なるメーカーのものを選ぶ場合は、使用する機種に対応しているかどうかを確認しましょう。

7．運転モード（Fastモードの有無）

リアルタイムPCR装置の中には、反応温度を上げ下げするスピードを変えて、1回の結果が出るまでの待ち時間を短縮できる「運転モード」を備えているものもあります。運転モードは通常2種類で、StandardモードとFastモードがあります。
Standardモードは、一般的なリアルタイムPCRの速度で、1時間半～2時間ほどの待ち時間となります。
一方、Fastモードは30～40分など、通常の1/3ほどの時間で結果が出ます（※メーカーによって異なるため、あくまで参考値です）。
Standardモードの方が処理能力は高く、一度に大量のサンプルを処理できますが、限られた時間内で実験を行いたいという場合は、Fastモードのある装置を選ぶのもおすすめです。

8．操作性

タッチパネルの有無や使いやすさ、付属のPCの有無、解析ソフトの内容や使いやすさ、装置の大きさなど、実験室での装置の操作性が良いかどうかも非常に重要です。
タッチパネル搭載のスタンドアロン式であれば、PCなどを使わずにタッチパネル上で実験の設定や増幅曲線の確認などを行うことができます。また、操作方法が分かりやすいか、使用者の言語に対応しているかも大事なポイントです。



リアルタイムPCRには、装置そのものはもとより、検出方法や試薬などにもいろいろな種類があり、装置選びに迷う方も多いのではないかと思います。結局のところ最も大切なのは自分のやりたいことが実現できる装置かどうかです。

池田理化は、1931年の創業以来、研究者の皆さまをサポートしてきたノウハウや経験に基づき、常時3,000 社を超える取り扱いメーカーの製品から最適な機器をご提案します。
選び方に迷ったときや、特別なアプリケーションが必要な場合など、リアルタイムPCRで分からないことがあれば、ぜひ当社までご相談ください。

おすすめのリアルタイムPCRメーカー

池田理化の豊富な取り扱い製品から、おすすめのメーカーと機種をご紹介します。（メーカー五十音順）

アズワン

おすすめ機種と一押しポイント

タカラバイオ

おすすめ機種と一押しポイント

日本ジェネティクス

おすすめ機種と一押しポイント

バイオ・ラッド ラボラトリーズ

おすすめ機種と一押しポイント

ライフテクノロジーズジャパン

おすすめ機種と一押しポイント

池田理化ではご紹介した機種以外にも、幅広い製品を取り扱っております。
リアルタイムPCRをお探しの方は、オンラインカタログから他の機器もご覧ください。

リアルタイムPCRを探す

プライマー設計時に考慮すべき8つのポイント

最適なプライマー設計はリアルタイムPCRを成功させるために重要なポイントのひとつです。
プライマー設計がうまくいかないと、反応効率が落ちたり、目的外の反応が起きたりしてしまいます。

プライマー設計の際は、以下の8つのポイントに注意しましょう。

	ポイント	補足
1	プライマーのサイズは17～25塩基	プライマーが長すぎるとアニーリング効率が低下し、短すぎると特異性が低下する。
2	増幅サイズは80～150bp	増幅サイズが大きすぎると増幅効率が落ちるため、増幅しきれない場合がある。
3	特異性の高い配列を選ぶ	ターゲットとする配列のみを増幅させるため、ターゲットに特異的な配列にプライマーを設定するとよい。 特異的な配列の検索には、NCBIの BLAST や primer BLAST などを利用する。（いずれも外部サイトへ）
4	2つのプライマー（※7）のTm値（※8）を揃える	2つのプライマーのTm値の差が大きいと、低い温度ではTm値の高いプライマーが鋳型DNAと非特異的に結合してしまう。高い温度ではTm値の低いプライマーが鋳型DNAと結合できず、反応がうまくいかない。 2つのプライマーの差は5℃以内におさめるのが望ましい。
5	3’末端配列はGまたはCが望ましい	ATと比べてGC間の結合は強いため、3’末端はGまたはCが望ましい。 特に3’末端がTのプライマーは、非特異的な結合をしやすいため避けた方がよい。
6	GC含有量は40～60％	それぞれがバランスよく含まれているのが望ましい。GやCの含有量が多すぎる場合は特異性が低下し（※9）、AやTの含有量が多すぎる場合はプライマーと鋳型DNAの結合が安定しない。
7	配列に偏りがない	配列内で4つの塩基の配置に偏りがない方が安定しやすい。GCリッチやATリッチな配列は避ける。 GGGGGのように局所的に同じ塩基が連続する配列も望ましくない。
8	プライマー内・プライマー間での相補的な配列は避ける	1つのプライマー内に相補的な配列が3塩基以上ある場合（注1）、プライマー自身が相補的な配列で結合してしまい、二次構造を形成する可能性がある。 2つのプライマー同士で相補的な配列が3塩基以上ある場合（注2）、プライマー同士が結合し、プライマーダイマーを形成してしまう可能性がある。 いずれの場合も反応効率の低下を招く。 （注1、2：ただし3’末端の場合は2塩基以上） どうしても相補的な配列が避けられない場合は、アニーリング温度をTm値より数℃高くすることで上記のような現象を抑えることができるが、極力避けた方がよい。

特異性の高い配列や最適なTm値の検討には、専用サイトやソフトウェアを用いるのがよいでしょう。

また、リアルタイムPCRを成功させるためには、プライマー設計のほかにも、さまざまな反応条件を最適化させることが重要です。
温度やサイクル数、pH、サンプル・酵素・dNTP・Mg2+・プライマー濃度、阻害物質（※10）の有無など、あらゆる要素を検討する必要があります。

広く研究対象となっている遺伝子であれば、メーカーでこれらの反応条件まで最適化された既製品がラインナップされています。
自作よりもコストはかかりますが、プライマー設計や反応条件の検討が不要な点は大きなメリットです。


※7 2つのプライマー…　ターゲットとする配列を挟むようにして、前方に結合するプライマー（ForwardもしくはSense）と後方に結合するプライマー（ReverseもしくはAntisense）のこと。
※8 Tm値…　融解温度とも言う。二本鎖DNAの50%が一本鎖DNAになる温度のこと。プライマーの場合、プライマーの50%が鋳型DNAに結合する温度のこと。
※9…　GC含有量が多いほどプライマーのTm値は上がり、アニーリング温度が高いほど非特異的な結合が発生しやすくなる。
※10 阻害物質…　ホルムアミドや尿素、エタノールなどの有機溶媒、重金属など。

リアルタイムPCRでよくあるトラブルとその対処法

この章ではリアルタイムPCRでよくある2つのトラブルと、その原因・対処法をご紹介します。

同一サンプル間でCt値がバラつく

リアルタイムPCRでは同じサンプルを複数ウェルに入れ、それらで同じ結果が得られるかどうか確認することで、実験の精度チェックを行うことがあります。
ところが、同じサンプルを入れて同じ処理を行っていても、ウェル間でCt値が大きくずれてしまうことがあり、主に下記のような原因と対処法があげられます。

主な原因	対処法
サンプルがうまく取れていない	ボルテックスミキサーやタッピングで、しっかりサンプルを撹拌する ピペットチップや保存チューブを低吸着タイプにする
最適化が不十分	プライマーの設計や反応条件を見直す 純正品の試薬キットを使う チューブやプレートなどの消耗品を純正品にする 作業条件を見直す（サンプルの温度管理や室温、作業時間など）
ピペットを扱う技術が不足している	正確な検量線を作成できるかどうか確認する 別の人に同じプロトコルを試してもらう
サンプルの質が悪い	元サンプルの管理や処理状態を見直す 抽出手順の見直す（※11） 精製手順の見直す（※12） 融解曲線解析（※13）を行い、プライマーダイマーや非特異的産物の有無を確認する
試薬が劣化している	凍結融解を繰り返すと試薬の劣化に繋がるため、なるべく避ける 新しい試薬を使う

※11… 抽出用試薬の中にはProteinase Kなどの強力なタンパク質分解酵素が含まれていることがあるが、それが失活していない場合に増幅試薬中の酵素が分解され増幅されないこと（増幅不良）がある。
※12… 会話や咳による飛沫にはDNaseやRNaseなどのNuclease（核酸分解酵素）が含まれるため、マスクなどで対策する。
※13 融解曲線解析…　融解曲線とは、インターカレーター法を用いて、温度上昇時に二本鎖DNAが一本鎖DNAになる際の蛍光強度の変化をグラフにしたもの。Tm値はこれによって算出される。目的のPCR産物と、プライマーダイマーや非特異的産物のTm値に差があることを利用して、それらの有無を解析する手法のこと。

増幅曲線がおかしい

ROX補正（※14）やベースライン補正（※15）がうまくできていなかったり、プローブが劣化をしていたりすると、増幅曲線がおかしな挙動を示すことがあります。代表的な例と、主な原因・対処法をご紹介します。

現象	主な原因	対処法
増幅曲線の蛍光強度が低い、ガタつく	【ROX補正が不適切】 ROX色素の添加量が多すぎる ばらつきがある	適切な添加量を入れる マスターミックス（※16）を用いる
	【ベースライン補正が不適切】 インターカレーター法の場合 鋳型DNAが多すぎる場合、その二本鎖にもインターカレーターは結合するため、ベースラインが上昇してしまう場合がある プローブアッセイ法の場合 「プローブ未結合の残存蛍光色素が含まれている」「標識効率が悪い」「クエンチャーによる蛍光抑制が不十分」など、プローブの質が悪い	鋳型DNA量を最適な濃度に調製し直す プローブの精製度や設計を見直す
	【プローブの劣化】 保存環境が不適切で、分解したり、特異性が消失したりしている 時間経過による褪色	適切な温度管理を行うなど、保存状態を見直す 使用期限を過ぎたものは使わない
増幅曲線が右肩下がりになる	鋳型DNA量が多いほど、増幅曲線の立ち上がりは早くなる。 立ち上がり部分がベースラインと見なされることで、斜めに傾いた増幅曲線になることがある。	生データをみて、ベースラインを設定し直す 鋳型DNA量を最適な濃度に調製し直す

※14 ベースライン補正…　蛍光シグナルにほぼ変動がない初期サイクル数域にみられるPCRにおけるバックグラウンドやノイズの蛍光シグナルを差し引くために行う補正のこと。
※15 ROX補正…　ウェル間のばらつきを標準化するための補正のこと。ROXはPCR中に蛍光レベルが変化せず、PCRにも影響を与えない蛍光色素のため、各ウェル間の僅かな反応液量の違いによるズレを補正するための指標になる。
※16 マスターミックス…　PCRに必要な成分をまとめて調製した反応液のこと。1反応分ずつ個別に調製すると時間がかかるだけでなく、比率にばらつきが出てしまい、正確性に欠ける。


このほかにもリアルタイムPCRがうまくいかない事例はさまざまです。また、ピペットや機器が精度を失っている可能性もあります。
ご紹介した対処法で解決しない場合や上記以外のトラブルのある場合は、メーカーもしくは販売代理店に ご相談 ください。

まとめ

この記事では、リアルタイムPCRの原理や手法、選定のポイント等について解説いたしました。今回の記事を、適切なリアルタイムPCRの選択にお役立てください。

池田理化は、研究者の皆さまをサポートする理化学総合商社として、オンラインカタログや実験室モデルプランなど便利なコンテンツをご提供しています。ぜひ、機種の選定や実験室の立ち上げにお役立てください。
またオンラインカタログ掲載品以外にも、当社は各種設備・機器・試薬・消耗品を豊富に取り扱っております。ご不明な点などございましたら、お気軽にお問い合わせください。皆さまの実験・研究に最適な製品をご提案いたします。