HPLCとは？基本情報や選定ポイント、おすすめメーカーまでご紹介

2024.10.7

HPLC（高速液体クロマトグラフィー）は、液体に溶解している物質を分離・分析することができる機器です。

この記事では、これからHPLCを使用する予定の方のために、機器の基本的な情報と使用方法についてご説明いたします。あわせてHPLCを選ぶ際のポイントも解説しますので、新規購入や買い替え時のご参考になりましたら幸いです。

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目次

HPLC（高速液体クロマトグラフィー）とは

HPLCは「High Performance Liquid Chromatography」の略称で、液体クロマトグラフィーとも呼ばれる分析手法です。クロマトグラフィー（※1）の一種で、液体中の物質を固定相との相互作用の差によって成分ごとに分離します。

末尾の違いで、クロマトグラフィーは測定方法、クロマトグラムは測定結果、クロマトグラフは機器を指しますが、便宜的に機器を「HPLC」と呼んだり、「液クロ」という略称で呼んだりします。（※ 本記事では「HPLC」を機器名称として用いています）

また、HPLCと類似した名称に、LC（Liquid Chromatography）やUHPLC（Ultra High Performance Liquid Chromatography）があります。
LCは、メーカーによってHPLCやUHPLCを包括する意味合いで使われることもありますが、HPLCとUHPLCは明確に区別されており、UHPLCの方がより高い分解能を持ちます。


※1 クロマトグラフィー…　分離手法のひとつ。固定相への物質の吸着力の差を利用して、色々な物質が混ざった混合物から、純物質を分離する。

HPLCの使用目的

HPLCとGC（ガスクロマトグラフィー）の違い

HPLCの仕組みと原理

HPLCは、主に「送液ポンプ」「試料注入装置（インジェクター）」「検出器」から構成される装置です。また、使用時には「移動相」「固定相」も欠かせません。

「移動相」は「溶離液」とも呼ばれ、注入されたサンプルを運ぶ役割をする溶媒です。「固定相」はサンプル中の成分を保持する役割をしており、一定の特性を持つシリカゲルや樹脂などが充填された「カラム」がこれに当たります。

「送液ポンプ」は移動相を一定の流速に保って送る機器です。移動相は必要に応じて、移動相内に気体が残存しないよう「脱気装置」で処理されます。
「試料注入装置」からサンプルを移動相に注入すると、サンプルはチューブを介してカラムに到達し、カラムの内部で固定相との間に相互作用が起こります。固定相との相互作用が強い成分は遅く、弱い成分は速くカラムを通過するため、この速度差を利用してサンプル中の成分を分離します。また、条件によっては「カラムオーブン」を用いて、カラムの温度を一定に保つ必要があります。
最後に「検出器」で分離された成分が検知され、分析用ソフトウェアを搭載したＰＣ（データ処理装置）によって分析データを出力する仕組みです。

HPLCの4つの分離方法

HPLCによる成分の分離方法は大きく4種類あります。ここでは「逆相クロマトグラフィー」「順相クロマトグラフィー」「イオン交換クロマトグラフィー」「サイズ排除クロマトグラフィー」について、それぞれの分離方法の特徴を違いや特徴をご説明します。

逆相クロマトグラフィー

順相クロマトグラフィー

イオン交換クロマトグラフィー

※陽イオン交換クロマトグラフィーの場合

固定相と溶質の間に働く「静電的相互作用」を利用して分離を行う方法です。

イオン化するサンプルが分析対象で、「陽イオン交換クロマトグラフィー」と「陰イオン交換クロマトグラフィー」の2種類があります。陽イオンの分析にはマイナスの電荷、陰イオンの分析にはプラスの電荷のイオン交換基が修飾された固定相が用いられます。
また、イオン交換基のイオン強度には強弱があり、分析対象となる成分の電荷や特性に合わせた選択が必要です。分析対象と同様に、移動相も固定相とは逆に荷電しているため、分離対象の成分と移動相のそれぞれが固定相に吸着・脱離を繰り返しながら、カラム内を移動していきます。

イオン交換基への結合力の強い成分ほどカラムを遅く通過し、弱い成分ほど速く通過します。また、対象成分のイオン価数によっても、固定相のイオン交換基への吸着に強弱が生まれ、分離スピードに差が生じます。同じ価数でも同族元素でイオン半径が小さいイオンほど、固定相への吸着は弱まり、溶出が早くなります。

サイズ排除（分子量分布）クロマトグラフィー

サイズ排除（分子量分布）クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography；SEC）は、サンプルの分子サイズの違いを利用する分離方式です。

固定相には主に多数の細孔が開いた架橋体ゲルなどが用いられます。移動相がカラムを通過していく際、分子サイズが小さい成分ほど細孔の影響を受けて流れが遅くなり、分子サイズが大きい成分ほど速く通過することを利用して対象成分を分離します。

SECには大きく「ゲル浸透クロマトグラフィー（Gel Permeation Chromatography；GPC）」と「ゲルろ過クロマトグラフィー（Gel Filtration Chromatography；GFC）」の2種類があります。
GPCは「疎水性の固定相／非水系（有機溶媒）の移動相」を使用し、有機溶剤に可溶な合成高分子の検出などに用いられます。
GFCは「親水性の固定相／水系の移動相」を使用し、タンパク質などの水溶性の生体高分子の分離や、分子量測定に用いられます。

HPLCの検出器と検出可能物質

HPLCでは、目的に応じて複数の検出器を使い分けます。ここでは、代表的な3つをご紹介します。

この他、任意の複数波長の吸光度を時間軸で測定可能な「多波長検出器（PDA検出器）」た、イオン化した成分の検出に適した「電気伝導度検出器」、酸化・還元など電気的に活性な成分の検出に適した「電気化学検出器」などがあります。

HPLCの定性分析と定量分析

HPLCでは定性分析（成分の判定）と定量分析（成分量の決定）、2種類の分析が可能です。

HPLCの使用方法

HPLCの一般的な使用手順は以下の通りです。

上記は一般的な手順であり、実際の操作方法は製品により異なる場合があるため、ご注意ください。

HPLCを選ぶ3つのポイント

HPLCはさまざまな機器から構成されています。この章では、それぞれの選定ポイントを順にご説明します。

最適なHPLCを選定するには、HPLCを構成する各種パーツを目的に合わせて選択する必要があります。池田理化では多くのメーカーの製品の中から適切なHPLCの組み合わせをご提案します。

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１．送液ポンプのスペック

流量

HPLCの使用目的によって必要な流量は異なります。それぞれの目的に必要な流量の参考値は下記の通りです。

※3 セミミクロLC…　同じ充填剤で通常サイズよりも内径の小さなカラムを用いることで、移動相の消費量を減らす手法のこと。内径が細くなる分、必要な流量は少なくなる。

送液方式

ポンプは吐出から吸引工程への切り替わりのタイミングにどうしても脈動が生まれてしまいます。しかし、送液の際に発生する脈動はHPLCの分析結果に影響を与えてしまうため、最低限に抑える必要があります。このため、HPLC用のポンプには主に「ダブルプランジャー方式」が用いられており、2つのプランジャーがお互いを補うような形で働きます。

この方式は主に下記の2種類に分けられ、以下のような特徴があります。

直列プランジャー方式

並列プランジャー方式

グラジエント分析の必要有無

「グラジエント分析」とは、移動相の混合比率を連続的に変化させながらサンプル中の成分を分離させる手法のことで、比率の調整には送液ポンプが用いられます。

出力の異なるポンプを並列運転で使用すると、圧力差が生じます。仮にポンプが2台あれば、この圧力差を利用して2液のグラジエント分析を行うことができます。移動相の混合は高圧下で行われるため、「高圧グラジエント」と呼ばれます。
また、電磁弁による制御により、1台で複数の液体を混合できる送液制御システムもあります。移動相の混合は大気圧下、すなわち、低圧下で行われるため、「低圧グラジエント」と呼ばれます。

それぞれのメリット・デメリットは以下の通りです。

目的とする分析に最適な移動相の混合比率を、手作業で探していくのは大変です。グラジエント分析は決まったプロトコルの分析を日常的に行う目的の場合には必要ありませんが、研究開発などにおいては重要なポイントとなるでしょう。

２．検出器の種類

HPLCの検出器には吸光度・蛍光・電気伝導度・示差屈折率検出器など複数の種類があり、検出できる成分や取得できるデータが異なります。分析対象に応じ、適切な検出器を使用しましょう。

紫外可視検出器では吸光物質が測定でき、多くのサンプルに対応可能です。蛍光検出器では蛍光物質の測定ができ、対象は限られますが高感度の検出が可能です。電気伝導度検出器は無機イオン、質量分布検出器はイオン性化合物の検出に適しています。また、示差屈折率検出器や蒸発光散乱検出器のように、ほぼすべてのサンプルを検出できる検出器もあり、これらはユニバーサル検出器とも呼ばれています。

「HPLCの検出器と検出可能物質」の章も参考にしてみてください。

３．拡張性の有無

将来的に機能を拡張できるかどうかも重要なポイントです。

決まったプロトコルの分析を日常的に行うのであれば、一体型タイプのHPLCの方が安価で良いでしょう。一方で、研究開発では将来的に機能拡張が必要になる場合が多いです。

たとえば、分取を行う可能性のある場合は「フラクションコレクター」など、各種オートメーション機能への対応可否を確認しておきましょう。
また、既存機器のある場合に追加で新規購入を検討している場合は、既存機器とのデータの統合管理は可能かどうか確認しておくとよいでしょう。

将来的に分離した成分をさらに詳細に調べたいとい可能性のある場合には、MS（Mass Spectrometry、マス、質量分析計）との接続が可能かどうか、事前に確認しておくことをおすすめします。

HPLCの移動相（溶離液）・固定相（カラム）の選び方

HPLCは、移動相とともにサンプルが固定相を通過する際の相互作用の差を利用して、サンプルを成分ごとに分離・分析する仕組みです。このため、固定相や移動相が分析結果に与える影響は大きく、最適な固定相・移動相の選定は非常に重要です。

ここでは、固定相・移動相の選び方をご紹介します。

移動相（溶離液）の選定

一例として、アセトニトリルとメタノールの特徴を比較表にまとめました。このような特徴を理解して、それぞれのサンプルに最適な溶媒・組み合わせを検討することが重要です。

	吸光度	カラム圧力	溶出力	粘性の変化	分離の選択性	緩衝液との混合による 析出の可能性	水との混合による 反応熱
アセトニトリル	低い	低い	大きい	小さい	化合物の特性による	高い	吸熱
メタノール	高い	高い	小さい	大きい		低い	発熱

固定相（カラム）の選定

いずれの場合も、太ければよい・長ければよいといったことはなく、目的に合わせて最適なカラムを選ぶことが重要です。分析対象となるサンプルで、ピークが一番きれいに出て、最適な分離度となる条件を探しましょう。

おすすめのHPLCメーカー

池田理化の豊富な取り扱い製品から、おすすめのメーカーと機種をご紹介します。（メーカー五十音順）

アジレント・テクノロジー

おすすめ機種と一押しポイント

おすすめ機種と一押しポイント

サーモフィッシャーサイエンティフィック

おすすめ機種と一押しポイント

おすすめ機種と一押しポイント

日本ウォーターズ

おすすめ機種と一押しポイント

おすすめ機種と一押しポイント

池田理化ではご紹介した機種以外にも、幅広い製品を取り扱っております。
HPLCをお探しの方は、オンラインカタログから他の機器もご覧ください。

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HPLCのよくあるトラブルとその対処法

HPLCにはさまざまなトラブルがありますが、その原因も「サンプルの調整ミス」「機器設定のミス」「移動相や固定相などの条件が不適」など、さまざまな要素が関わっています。

ここでは代表的な事例とその原因・対処法を簡単にご紹介いたします。
（※ ご紹介している内容は、あくまで一例です。問題が解決しない場合は、メーカーもしくは販売代理店に ご相談 ください。）

１．ゴーストピークが出てしまう

原因と対策

原因	対策
サンプルに夾雑物が含まれている	フィルターで前処理する
ニードルで前のサンプルをキャリーオーバーしている	・ニードルの洗浄、材質の見直し ・洗浄液の見直し
サンプル溶媒の溶存空気・酸素	溶存空気・酸素を除去する
カラムやバイアルが汚れている	① 洗浄する／新しくする ② 別ブランドを試す
セプタムの成分が溶出している	サンプルに合わせてPTFEなどの耐薬品性の高いセプタムを使う
移動相が汚染している	① 継ぎ足ししない／長期使用は控える／新しいものを使う ② 別ブランドを試す
実験室内の空気中の成分が移動相に溶け込む	トラップを設ける

上記の他に、原因特定の難しい場合は、妨害成分を除去するためのカラムもあるので、活用してみるとよいでしょう。

２．ノイズが入ってしまう

原因と対策

原因	対策
ポンプの圧力にムラがある	・パージ（呼び水動作）でポンプから空気抜きを行う ・液漏れや詰まり、異音がないか確認する
脱気装置（※6）が安定していない ※6 脱気装置…　水に含まれる気体を除去する装置のこと	・測定の前日から脱気装置を立ち上げておく ・装置内部を溶媒で十分に置換する
検出器の汚れや劣化、セル内の気泡	清掃や部品交換、エア抜きを行う
室温の変化や直風の影響	・温度管理を行う ・直風を避ける
移動相に溶解している空気・酸素	十分な時間、脱気する
移動相やセル、カラムの劣化	① きれいにする／新しいものに変える ② 別ブランドを試す

３．圧力が安定しない

流路の詰まりや気泡、液漏れが原因で、圧力が高くなったり低くなったり、安定しないことがあります。

原因と対策

原因	対策
流路が詰まっている	・下流から順に配管を外して、詰まっている場所を特定し、洗浄や部品交換を行う ・そもそも詰まりにくくするために前処理フィルターでサンプルや移動相の不純物は除去しておくとよい ・使用後はしっかりと洗浄を行う
気泡を含んでいる	シリンジなどを用いて移動相を引き込十分に通液する
液漏れしている	① バルブの閉まり具合、各接続部が正しくつながっているか確認する ② 劣化したシールや部品を新しいものに交換する
移動相が足りない	・移動相を十分量にして、気泡を除くために一定時間通液する （※ 合わせてカラムが枯れた場合、各カラムメーカーの取り扱い方法に従って早急に一定時間通液すると復活する場合がある）
移動相が最適でない	種類や流量、カラムとの相性などを見直す

なお、溶媒として水を使用している場合は長期使用でバクテリアが発生して詰まりの原因になることがあります。精製水は塩素などが除去されており、腐りやすいため、放置せず、必ず新しいものを使用するようにしましょう。

４．保持時間が安定しない

保持時間とは、サンプルが注入されてから各物質が検出されるまでに要する時間のことです。
劣化や気泡などの原因に加え、条件の最適化が不十分な場合に発生します。

原因と対策

原因	対策
カラムの劣化（保持時間が短くなる）	カラムの洗浄や交換を行う
送液量が不安定	① メスシリンダーなどで安定性の有無を確認する ② 気泡や液漏れがないか確認する
温度が不安定	・恒温槽やカラムオーブンで一定温度に保つ ・設定温度に合わせて室内温度も調整する
サンプルの溶媒の溶出力が移動相よりも高い	サンプルの溶媒を変更するか、サンプルを希釈する
サンプルの注入量が多すぎる	量を減らすか、希釈して同量入れる
移動相の組成が変化してしまった	組成変化の原因を取り除き、正しい組成の移動相を使う
カラムの平衡が不十分	平衡時間を長めに設ける

５．ピーク形状が悪い

正常なピークは本来シャープなものです。異常なピークといっても形状はさまざまで、ピーク前後いずれかがだれてしまうリーディングやテーリング、左右にだれて広がってしまうブロードなどがあります

主にカラムの性質やカラムとの相性に起因するため、原因を特定するのが困難ですが、下記のような点を見直すことで、改善する可能性があります。

６．マイナスピークが生じる

原因と対策

原因	対策
サンプルの溶媒と、移動相の溶媒の組成が著しく異なる	サンプルの溶媒を変更するか、サンプルを希釈する
検出項目において、移動相がサンプルよりも顕著な性質を持つ （屈折率大きい、吸光度が大きいなど）	移動相を変更するか、条件を変更する
移動相の再利用によりサンプル成分が移動相に溶け込んでいる	目的成分の少ないサンプルを添加したときにマイナスピークが発生してしまうたため、移動相を作り直すか、標準試料を注入して検量線を引き直す

まとめ：測定時のチェックポイント

以上のようにHPLCのトラブルは、複合的な要素に原因がある場合も多いです。また、ひとつの原因が複数のトラブルを発生させることもあるため、原因究明が困難です。

トラブル時には「いつ」「どこで」「何が」「どのように」「どれくらい」起きているのかを調査し、それらの「なぜ」を突き止める必要があります。通常時との「違い」をシステムの上流から下流までよく観察して、俯瞰的に原因を推察しましょう。

なお、ここまでにご紹介したトラブルの未然に防ぐためのチェックポイントを簡単にまとめました。

上記チェックポイントを確認してもなおトラブルが解決しない場合は、メーカーもしくは販売代理店に相談してください。

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HPLCのメンテナンス方法

まとめ

HPLCは、多種多様なサンプルの成分を分離・分析でき、薬学や食品をはじめ幅広い分野で利用されている機器です。
HPLCの導入にあたってより詳しい情報を確認したい方は、ぜひ池田理化にご相談ください。研究テーマや取り扱うサンプルなどに合わせて、最適な情報をご提供いたします。

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